Opinnäytetyö tehtiin Jyväskylän yliopiston bio- ja ympäristötieteiden laitokselle. Työ oli osana laa-jempaa projektia, jonka tavoitteena on kehittää automatisoitu mikrobiologinen laadunvalvontatesti teollisuusprosesseihin. Projektin koordinoijana toimii akatemiatutkija Marja Tiirola Jyväskylän yliopiston bio- ja ympäristötieteiden laitokselta.

Opinnäytetyön tavoitteena oli saada automatisoitu RNA:n eristysmenetelmä Thermon Scientific KingFisher -magneettipartikkelirobotilla. Laitteella oli tarkoitus tehdä cDNA synteesi lysatoidulle E. colille. Tutkimuksessa E. coli -pelletit homogenisoitiin 70 %:ssa etanolissa FastPrepillä. Homogenisoinnin jälkeen E. coli -lysaatit puhdistettiin KingFisher-robotilla. Puhdistetuille tuotteille tehtiin kään-teistranskriptio, jolloin yksijuosteisesta RNA:sta muodostui kaksijuosteista komplementaarista DNA:ta, cDNA:ta. Käänteistranskription jälkeen tuotteessa vielä jäljellä oleva alkuperäinen RNA poistettiin ribonukleaasi I (RNase I) -käsittelyllä.

Tutkimuksen perusteella paras kokonaisuus käänteiskopioitaessa RNA-fragmenttia oli seuraavanlainen: reaktiolämpötila oli 55 oC ja entsyyminä käytettiin RevertAidin Premium käänteistranskriptaasia. Lämpötilaohjelmassa lämpötila nostettiin ensin 65 oC:een, laskettiin sen jälkeen 10 oC:een ja vasta sitten lämpötila nostettiin reaktiolämpötilaan. Näin saatiin hajotettua RNA:n sekundäärirakenteet ja käänteistranskriptio onnistui paremmin. Käänteistranskription jälkeen RT-tuotteelle tehtiin RNase I -käsittely ja sopiva RNase I:n määrä käsittelyyn oli 0,3 µl.

Pelkkä Thermon KingFisher -magneettipartikkelirobotilla tehtävä puhdistus jätti tuotteeseen liikaa epäpuhtauksia. Epäpuhtaudet estivät käänteistranskriptioreaktion, joten epäpuhtaudet oli poistettava ennen Thermon KingFisher -robotilla tehtävää puhdistusta. Tässä tutkimuksessa epäpuhtaudet poistettiin fenoliesikäsittelyllä. Fenolikäsittelyn jälkeen entsymaattiset reaktiot onnistuivat hyvin.