Abstract

Prolyl hydroxylases catalyze the post-translational formation of 3- and 4-hydroxyprolines in polypeptides. To date, two prolyl 4-hydroxylase families are known to exist: collagen prolyl 4-hydroxylases (C-P4Hs) which reside in the endoplasmic reticulum, and hypoxia-inducible factor prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs) which reside in either the cytoplasm or nucleus. C-P4Hs and HIF-P4Hs belong to the 2-oxoglutarate dioxygenase family and require Fe2+, 2-oxoglutarate, O2 and ascorbate in their reaction. C-P4Hs are critical enzymes in collagen biosynthesis since the formation of 4-hydroxyproline residues stabilizes the collagen triple helix at body temperature. HIF-P4Hs regulate, through hypoxia-inducible factor HIF, the expression of genes that are essential for the survival of cells during hypoxia.

This thesis reports the cloning and characterization of two novel P4Hs, from human and a plant, which show some distinct features when compared to previously characterized P4Hs. The human P4H was found to have a unique transmembrane domain, with its catalytic region residing inside the lumen of the endoplasmic reticulum, its subcellular localization thus being identical to that of the C-P4Hs. However, unlike C-P4Hs, it hydroxylated HIF-α both in vitro and in cellulo. Furthermore, its expression level was induced in hypoxic conditions in most of the cell lines studied. The Arabidopsis thaliana P4H had distinct differences in its substrate specificity when compared to another previously characterized A. thaliana P4H. Interestingly, the putative peptide binding regions of the two new P4Hs characterized in this study shared some homology.

Three prolyl 3-hydroxylase (P3H) isoenzymes are known to exist in vertebrates and they also belong to the 2-oxoglutarate dioxygenases. It is known that 3-hydroxyprolines are found only in collagens, being most abundant in type IV collagen. The function of this modification is as yet poorly understood, but its absence in collagen I has recently been shown to lead to recessive lethal osteogenesis imperfecta. The human P3H isoenzymes were cloned during these thesis studies, and were expressed as recombinant proteins. The kinetic properties of one of them, P3H2, which was found to be expressed in structures rich with basement membranes, was studied in detail.

Tiivistelmä

Prolyylihydroksylaasit ovat entsyymejä, jotka katalysoivat 3- ja 4-hydroksiproliinien muodostumisen valkuaisaineissa. Nykyisin tunnetaan ainakin kaksi prolyyli-4-hydroksylaasien (P4H) entsyymiperhettä: endoplasmakalvostossa sijaitsevat kollageeni prolyyli-4-hydroksylaasit (kollageeni-P4H:t) sekä vähähappisissa olosuhteissa aktivoituvaa transkriptiotekijää, hypoksiaindusoituvaa faktoria (HIF), hydroksyloivat prolyyli-4-hydroksylaasit (HIF-P4H:t). HIF-P4H:t sijaitsevat sytoplasmassa ja tumassa. Sekä kollageeni-P4H:t että HIF-P4H:t kuuluvat 2-oksoglutaraattidioksygenaasien laajaan entsyymiperheeseen. Nämä entsyymit tarvitsevat kosubstraateikseen rautaa, 2-oksoglutaraattia, happea sekä C-vitamiinia. Kollageeni-P4H:t hydroksyloivat kollageenien proliinitähteitä ja ovat avainasemassa kollageenisynteesissä, sillä muodostuneet 4-hydroksiproliinitähteet ovat ehdoton vaatimus stabiilille kollageenirakenteelle. HIF-P4H:t säätelevät puolestaan niiden geenien ilmenemistä, jotka ovat välttämättömiä elimistön selviytymiselle vähähappisissa olosuhteissa. HIF-P4H:t hydroksyloivat HIF-transkriptiotekijän α-alayksikön tiettyjä proliinitähteitä hapen läsnä ollessa, joka ohjaa α-alayksikön proteasomaaliseen hajotukseen eikä aktiivista HIF transkriptiotekijää siten muodostu. Alentuneessa happipitoisuudessa HIF-P4H entsyymien toiminta estyy, HIF stabiloituu ja aktivoi kohdegeeniensä toiminnan. Kollageeni-P4H entsyymejä pidetään erityisen sopivina lääkekehityksen kohteina fibroottisten ja HIF-P4H entsyymejä iskeemisten sairauksien hoitoon.

Tässä väitöskirjatyössä on karakterisoitu aiemmin tuntematon ihmisen transmembraaninen P4H entsyymi (P4H-TM). Entsyymi osoittautui indusoituvan vähähappisissa olosuhteissa useissa solulinjoissa ja hydroksyloivan HIF-transkriptiotekijää muistuttaen siten HIF-P4H entsyymejä. Kuitenkin P4H-TM:n solulokalisaatio poikkesi HIF-P4H entsyymeistä, sillä sen havaittiin sijaitsevan endoplasmakalvostossa, katalyyttinen keskus kalvoston sisällä. Näiden tutkimustulosten valossa on oletettavaa, että tällä ihmisentsyymillä on HIF:n lisäksi toinen toistaiseksi tuntematon fysiologinen substraatti. Väitöskirjassa karakterisoitiin toinen lituruohon, Arabidopsis thalianan, P4H (At-P4H-2), joka poikkesi katalyyttisiltä ominaisuuksiltaan aiemmin karakterisoidusta lituruohon P4H:sta. Näiden kahden kasvientsyymin substraattivaatimusten poiketessa selvästi toisistaan, on niillä solussa todennäköisesti spesifiset tehtävät. At-P4H-2:n oletetulla substraatin sitomisalueella on jakso, joka on 37-prosenttisesti identtinen ihmisen P4H-TM:n kanssa, minkä vuoksi At-P4H-2:n karakterisoinnin uskottiin olevan tärkeä apuväline ihmisen P4H-TM:n tutkimuksissa.

Selkärankaisilla prolyyli-3-hydroksylaaseja (P3H) tiedetään olevan kolme, ja myös ne kuuluvat 2-oksoglutaraattidioksygenaaseihin. 3-Hydroksiproliinia esiintyy ainoastaan kollageeneissa, erityisesti tyypin IV kollageenissa, joka on tyvikalvojen tärkeä rakennekomponentti. 3-Hydroksiproliinin merkitystä ei tunneta vielä tarkoin, mutta tyypin I kollageenissa 3-hydroksiproliinin puutoksen on osoitettu johtavan vaikeaan luustosairauteen, osteogenesis imperfectaan. Väitöskirjatyössä ihmisen P3H:t kloonattiin ja tuotettiin rekombinanttiproteiineina. Yhden isoentsyymin (P3H2) katalyyttiset ominaisuudet määritettiin ja sen osoitettiin ilmenevän erityisesti kudoksissa, joissa on paljon tyvikalvorakenteita.